پرش به محتوا

آزمایش NIPT چیست؟ راهنمای کامل تعیین جنسیت و تشخیص تریزومی‌ها (روش NGS و Digital PCR)

    بررسی علمی و به‌روز غربالگری غیرتهاجمی پیش از تولد (NIPT) آزمایشگاه دنا، تعیین جنسیت جنین، دقت تست، زمان انجام، مزایا، محدودیت‌ها و تفاوت روش‌های NGS و Digital PCR بر اساس جدیدترین رهنمودهای بین‌المللی | قیمت تست NIPT، دقت، زمان جواب + راهنمای کامل

    پدر چگونه تعیین‌کننده جنسیت جنین است؟

    در سلول‌های بدن انسان 46 کروموزوم وجود دارد (22 جفت اتوزوم + یک جفت کروموزوم جنسی).

    • زنان: XX
    • مردان: XY

    سلول‌های جنسی (اسپرم و تخمک) هر کدام 23 کروموزوم دارند. تخمک همیشه حامل کروموزوم X است، اما اسپرم می‌تواند X یا Y باشد. بنابراین:

    • اگر اسپرم حامل X باشد → جنین دختر (XX)
    • اگر اسپرم حامل Y باشد → جنین پسر (XY)

    در نتیجه، از نظر ژنتیکی پدر تعیین‌کننده جنسیت جنین است.

    در تست NIPT با بررسی DNA آزاد جنینی (cffDNA) در خون مادر، وجود یا عدم وجود توالی‌های کروموزوم Y قابل شناسایی است؛ بنابراین تعیین جنسیت از هفته ۱۰ بارداری با دقت بالا امکان‌پذیر است.

    آنیوپلوئیدی و تریزومی چیست؟

    سلول طبیعی انسان دارای 46 کروموزوم است (Euploidy).
    هرگونه افزایش یا کاهش در تعداد کروموزوم‌ها را Aneuploidy (آنیوپلوئیدی) می‌نامند.

    شایع‌ترین نوع آنیوپلوئیدی، تریزومی (وجود سه نسخه از یک کروموزوم) است.

    شایع‌ترین اختلالات کروموزومی دوران جنینی

    1. تریزومی 21 – سندرم داون

    شیوع تقریبی: 1 در 800 تولد
    علائم شامل تأخیر ذهنی و برخی ناهنجاری‌های ساختاری است.

    2. تریزومی 18 – سندرم ادوارد

    مرگ‌ومیر بالا؛ تنها 5–10٪ تا یک‌سالگی زنده می‌مانند.

    3. تریزومی 13 – سندرم پاتو

    همراه با ناهنجاری‌های شدید مغزی و قلبی.

    حدود 70٪ ناهنجاری‌های کروموزومی سندرومیک شامل T21، T18 و T13 هستند.

    آزمایش NIPT چیست؟

    NIPT (Non-Invasive Prenatal Testing) یک تست غربالگری غیرتهاجمی پیش از تولد است که با چند میلی‌لیتر خون مادر انجام می‌شود و DNA آزاد جنینی را بررسی می‌کند.

    این تست:

    • از هفته ۱۰ بارداری قابل انجام است
    • ریسک سقط ندارد
    • دقتی بیش از 99٪ برای T21 گزارش شده است
    • تعیین جنسیت را نیز امکان‌پذیر می‌کند

    کشف DNA آزاد جنینی در سال 1997 توسط Dennis Lo نقطه عطفی در پرناتولوژی محسوب می‌شود.

    روش انجام NIPT چگونه است؟

    در خون مادر قطعات کوتاهی از DNA جفت (cffDNA) وجود دارد. این DNA:

    1. استخراج می‌شود
    2. مقدار آن اندازه‌گیری می‌شود
    3. نسبت کروموزوم‌های هدف (21، 18، 13 و گاهی X/Y) محاسبه می‌شود

    اگر نسبت یک کروموزوم بیش از حد طبیعی باشد، احتمال تریزومی مطرح می‌شود.

    روش‌های انجام NIPT

    1️⃣ NIPT مبتنی بر NGS (Next Generation Sequencing)

    در این روش:

    • توالی‌یابی گسترده ژنوم انجام می‌شود
    • داده‌ها با تحلیل بیوانفورماتیک بررسی می‌شوند
    • حساسیت و ویژگی بسیار بالا دارد

    مزایا:

    • استاندارد جهانی
    • دقت بالا

    محدودیت:

    • هزینه بیشتر
    • زمان آماده‌سازی طولانی‌تر

    2️⃣ NIPT مبتنی بر Digital PCR (dPCR)

    Digital PCR یک روش کمی‌سازی دقیق DNA است که در آن:

    • نمونه به هزاران پارتیشن تقسیم می‌شود
    • در هر پارتیشن PCR جداگانه انجام می‌شود
    • با تحلیل آماری Poisson تعداد دقیق مولکول‌های DNA محاسبه می‌شود

    مزایا:

    • سرعت بالاتر (نتیجه طی 48 ساعت)
    • هزینه کمتر نسبت به NGS
    • حساسیت و تکرارپذیری بالا

    این روش به‌ویژه در شرایطی که زمان اهمیت دارد (مثلاً نزدیک هفته 19 بارداری) گزینه مناسبی است.

    مزایای آزمایش NIPT

    • غیرتهاجمی (بدون خطر سقط)
    • دقت بالا (>99٪ برای T21)
    • انجام از هفته ۱۰ بارداری
    • تعیین جنسیت با دقت حدود 98٪
    • کاهش موارد مثبت کاذب نسبت به غربالگری‌های سنتی

    مطابق توصیه‌های American College of Obstetricians and Gynecologists و American College of Medical Genetics and Genomics، NIPT می‌تواند به عنوان یک گزینه غربالگری برای همه زنان باردار در نظر گرفته شود.

    همچنین Royal College of Obstetricians and Gynaecologists کاربرد آن را در چارچوب بالینی تأیید کرده است.

    چه کسانی کاندید مناسب انجام NIPT هستند؟

    • زنان بالای 35 سال
    • نتیجه غربالگری مثبت یا مشکوک
    • سابقه جنین مبتلا به اختلال کروموزومی
    • یافته‌های سونوگرافی پرخطر
    • بارداری IVF
    • سابقه سقط مکرر
    • افرادی که تمایل به اجتناب از روش‌های تهاجمی دارند

    محدودیت‌های NIPT

    • تست غربالگری است، نه تشخیصی
    • نتیجه مثبت نیازمند تأیید با CVS یا آمنیوسنتز
    • در برخی شرایط (BMI بالا، دوقلویی خاص، Mosaicism) ممکن است محدودیت داشته باشد

    سوالات پرتکرار

    آیا NIPT جایگزین آمنیوسنتز است؟

    خیر. در صورت نتیجه پرخطر، تست تشخیصی لازم است.

    آیا بارداری قبلی روی نتیجه اثر دارد؟

    خیر. نیمه‌عمر DNA جنینی کمتر از 2 ساعت است و پس از زایمان حذف می‌شود.

    آیا تعیین جنسیت قطعی است؟

    در صورت وجود کروموزوم Y، دقت بسیار بالاست؛ اما همچنان در چارچوب غربالگری گزارش می‌شود.

    جمع‌بندی تخصصی

    آزمایش NIPT تحول مهمی در غربالگری پیش از تولد ایجاد کرده است. این تست:

    • ایمن
    • دقیق
    • قابل انجام از هفته ۱۰
    • با توانایی تشخیص تریزومی‌های شایع و تعیین جنسیت

    می‌باشد.

    روش‌های مبتنی بر NGS همچنان استاندارد طلایی غربالگری مولکولی هستند، در حالی که Digital PCR با حفظ دقت، سرعت و مقرون‌به‌صرفه بودن را بهبود داده است.

    برای انتخاب بهترین روش، مشاوره ژنتیک پیش از انجام آزمایش توصیه می‌شود تا با توجه به سن، سابقه خانوادگی و یافته‌های سونوگرافی، تصمیم‌گیری آگاهانه انجام شود.

    پدر تعیین کننده جنسیت جنین


    روش جدید آزمایش NIPT – ان آی پی تی | انسان ها (شامل جنس مذکر و مونث) در همه سلول های بدنشان 46 کروموزوم دارند. کروموزوم ها مواد وراثتی هستند و جنسشان از DNA است. این 46 کروموزوم شامل کروموزوم های 1 تا 22 و کروموزوم های جنسی X و Y است. هر سلول از هر یک از کروموزوم های 1 تا 22، و نیز کروموزوم های جنسی، دو نسخه دارد که در مجموع شامل 46 کروموزوم می شود. کروموزوم های جنسی X و Y تعیین کننده جنسیت هستند. در جنس مذکر دو کروموزوم جنسی X و Y و در جنس مونث دو کروموزوم جنسی X وجود دارد.

    آزمایش nipt


    روش جدید آزمایش NIPT – ان آی پی تی | سلول های جنسی زن (تخمک ها) و سلول های جنسی مرد (اسپرم ها) نصف تعداد 46 کروموزوم را دارند. بدین معنا که اسپرم و تخمک هر یک حامل 23 کروموزوم هستند. این 23 کروموزوم شامل یک نسخه از کروموزوم های 1 تا 22 و یک نسخه از کروموزوم های جنسی است. زمانی که یک اسپرم و یک تخمک با هم لقاح پیدا می کنند ماده ژنتیک آن ها (یعنی کروموزوم ها) در کنار یکدیگر قرار می گیرند و یک سلول تخم را ایجاد می کنند.

    این سلول تخم 46 کروموزوم دارد که 23 عدد آن را از اسپرم (پدر) و 23 عدد دیگر را از تخمک (مادر) گرفته است. به همین دلیل است که سلول های جنسی اسپرم و تخمک هر کدام 23 کروموزوم دارند.


    در جنس مونث دو نسخه کروموزوم X وجود دارد بنابراین تمامی سلول های تخمک حامل کروموزوم X هستند. از طرف دیگر، در جنس مذکر، یک نسخه کروموزوم X و یک نسخه کروموزوم Y وجود دارد، پس نیمی از اسپرم ها حامل یک کروموزوم X و نیم دیگر حامل یک کروموزوم Y هستند. هنگام لقاح بسته به اینکه تخمک با اسپرم حامل کروموزوم X یا با اسپرم حامل کروموزوم Y لقاح یابد، جنسیت سلول تخم مشخص می شود. اگر اسپرم حامل کروموزوم Y باشد، جنسیت جنین حاصل پسر خواهد بود و اگر اسپرم حامل کروموزوم X باشد، جنسیت جنین حاصل دختر خواهد بود. بنابراین، در انسان ها، جنس مذکر (مرد) تعیین کننده جنسیت جنین خواهد بود.


    شایعترین اختلالات کروموزومی دوران جنینی، تری زومی ها هستند


    یک سلول تخم نرمال (طبیعی) حامل 46 کروموزوم است (دارا بودن 46 کروموزوم را اصطلاحاً یوپلوئیدی گویند). اگر اسپرم یا تخمک از نظر تعداد کروموزوم دارای نقص باشند (در مواردی این تغییر در تعداد کروموزوم ها طی لقاح رخ می دهد) می تواند منجر به کاهش یا افزایش تعداد برخی یا همه کروموزوم ها شود (نقص در تعداد کروموزوم ها را اصطلاحا آنیوپلوئیدی گویند).
    شایع ترین آنیوپلوئیدی ها در انسان، تری زومی ها هستند. زمانی که سلول تخم بجای وجود دو نسخه از یکی از کروموزوم ها حامل 3 نسخه از آن باشد به این حالت تری زومی گفته می شود. از تری زومی های رایج دوران جنینی می توان به تری زومی کروموزوم های 21، 18 و 13 اشاره کرد. بیماری حاصل از تریزومی 21 را سندرم داون گویند. تری زومی 18 نیز به سندرم ادوارد و تری زومی 13 به سندرم پاتو منجر می شوند.


    روش های بررسی سلامت جنین در دوران بارداری


    در صورتی که بخواهیم سلامت جنین را در دوران بارداری از نظر تری زومی های شایع کروموزومی بررسی کنیم، روش تشخیصی استاندارد طلایی، نمونه گیری از جنین (نمونه مایع آمنیون یا پرزهای کوریونی) و تهیه کاریوتایپ آنهاست. نکته مورد توجه این است که این روش ها تهاجمی هستند و با درصد کمی احتمال سقط همراهند و گاهی می توانند منجر به عفونت رحمی شوند. به این دلایل، در ابتدا غربالگری سرم مادر و بررسی های سونوگرافی برای شناسایی مادران باردار پرخطر (High risk) انجام می شود و بعد از مشخص شدن بالا بودن ریسک تری زومی، این افراد برای نمونه گیری تهاجمی و انجام آزمایشات تشخیصی ارجاع داده می شوند.


    همچنین، میزان موارد مثبت کاذب (مواردی که پرخطر گزارش می شوند اما در حقیقت جنین سالم است) در غربالگری های معمول (غربالگری از طریق بررسی مارکرهای بیوشیمیایی خون مادر) بالاست. به دلیل بالا بودن موارد مثبت کاذب در غربالگری، اغلب برای جنین های نرمال نیز نمونه گیری تهاجمی انجام می شود. علاوه بر، نرخ تشخیص در روش های معمول غربالگری پایین است.

    به همین دلایل، محققان روی توسعه روش های غربالگری غیرتهاجمی دوران جنینی (NIPT) کار می کنند. مزیت این روش غربالگری بر غربالگری معمول، قدرت بالای آن ها در شناسایی بارداری های پرخطر از نظر اختلالات شایع کروموزومی است.


    روش NIPT برپایه NGS و دیجیتال PCR


    DNA آزاد جنینی (cffDNA) در خون مادر اولین بار توسط Lo و همکاران در سال 1997 شناسایی شد. بطور میانگین، میزان cffDNA حدود 10-20 درصد DNA پلاسمای مادری بین هفته های 10 تا 21 بارداری است. این اکتشاف امکان بررسی غیرتهاجمی جنین در دوران بارداری (NIPT) را فراهم کرد. از زمان کشف cffDNA تاکنون، کسب دانش در زمینه cffDNA و توسعه سریع تکنیک های مولکولی جدید، باعث توسعه چندین روش NIPT شد. این روش ها برپایه NGS یا میکرواری هستند. NIPT برپایه NGS اولین بار سال 2011 معرفی شد. این روش جز حساس ترین و اختصاصی ترین روش ها برای غربالگری آنیوپلوئیدی های کروموزومی است (شامل T21، T18 و T13). روش NIPT برپایه NGS از سال 1396 تاکنون در آزمایشگاه دنا در حال انجام است.


    این روش ها گران قیمت هستند و انجام آن ها بسیار وقت گیر است. همچنین، برای انجام آن ها به آزمایشگاه هایی با تجهیزات ویژه نیاز هست. بنابراین، برای اینکه NIPT به عنوان یک تست غربالگری یونیورسال برای شناسایی تریزومی کروموزوم های 13، 18 و 21 در دوران جنینی پذیرفته شود نیاز به توسعه روشی سریعتر، آسانتر و مقرون به صرفه تر است که در عین حال همانند NIPT دقت بالایی نیز داشته باشد.
    برای بهبود روش NIPT و کاربرد آن به عنوان تست روتین غربالگری پیش از تولد جنین، NIPT برپایه دیجیتال (dPCR) ابداع شده است. مطالعات صورت گرفته با استفاده از روش دیجیتال PCR ثابت کرد که این روش، یک روش بسیار قدرتمند و دردسترس برای تعیین دقیق مقادیر بسیار کم DNA است. بنابراین، از این روش می توان برای توسعه روش NIPT با حساسیت بالا و قابلیت تکرارپذیری نتایج استفاده کرد.


    دیجیتال PCR چیست؟


    دیجیتال PCR، یک روش انداره گیری کمی اسید نوکلئیک (DNA) است. این روش اولین بار در سال 2007 به عنوان روشی برای شناسایی غیرتهاجمی آنیوپلوئیدی های کروموزومی معرفی شد. اساس این روش (dPCR) به این صورت است که تعداد زیادی واکنش PCR انجام می شود.. به این معنی که قبل از تکثیر DNA در واکنش PCR، تقسیم نمونه (DNA) به زیرواحدهای مجزا انجام می شود، در واقع پارتیشن بندی رخ می دهد. هر مولکول DNA الگو (که همان DNA آزاد جنینی است) می تواند وارد یکی از این واکنش ها (پارتیشن ها) شود و یا حتی واکنشی (پارتیشنی) وجود داشته باشه که DNA الگو وارد آن نشده باشد. در واقع، این پارتیشن بندی باعث می شود که تعیین تعداد مولکول اولیه DNA با دقت و حساسیت بالاتری انجام شود.


    در صورتی که DNA الگو وارد واکنش شود، طی انجام PCR، DNA الگو تکثیر می شود و بنابراین سیگنال (فلورسانت) مثبتی را ایجاد می کند. اما اگر DNA الگو وارد واکنش نشود، DNA الگویی وجود ندارد که از روی آن PCR انجام شود. در نتیجه واکنش سیگنال مثبت ایجاد نمی کند. بنابراین، تعداد مولکول DNA الگو در واکنش های اولیه را می توان با استفاده از سیگنال های مثبت شناسایی کرد و با روش آماری Poisson مقدار اولیه مولکول های DNA را تعیین کرد.


    اخیرا، آزمایشگاه دنا روش جدیدی به نام DeNIPT را راه اندازی کرده است. در این روش، سه کروموزوم 13، 18 و 21 بطور همزمان در یک واکنش با استفاده از روش dPCR مورد هدف قرار می گیرند. در این روش، میزان درصد DNA آزاد جنینی نیز مانند سایر روش های NIPT مشخص می شود. بعلاوه در این روش، تعیین جنسیت نیز امکان پذیر است. یکی از موارد اهمیت مشخص شدن جنسیت جنین در هفته های پایین بارداری (این آزمایش از هفته 10 بارداری قابل انجام است) سابقه بیماری های وابسته به X در خانواده است.

    بیماری هایی مانند دیستروفی عضلانی دوشن و بکر، سندرم فراژیل X، هموفیلی و بیماری هایی ازین قبیل که تنها جنس مذکر را درگیر می کند. در این موارد، می توان با انجام روش DeNIPT، هم سلامت جنین از نظر تری زومی های شایع و هم جنسیت جنین را بررسی کرد. در بیشتر بیماری های وابسته به X، در صورتی که جنسیت جنین، دختر باشد نیازی به نمونه گیری از جنین و بررسی جنین قبل از تولد (PND) وجود ندارد.


    پروسه کاری روش DeNIPT، به این صورت است که ابتدا cfDNA از پلاسمای مادر (حاوی cfDNA مادر و جنین است) استخراج می شود. این DNA به مخلوط واکنش PCR اضافه می شود. مجموعه پروب و پرایمرهای اختصاصی که مولکول های DNA کروموزوم های 21، 18 و 13 را هدف قرار می دهند در مخلوط واکنش وجود دارد. واکنش تکثیری PCR انجام می شود.

    مولکول های DNA هدف از کروموروم های 21، 18 و 13 تکثیر می شوند. و در نتیجه سیگنال فلورسانت مربوط به هر کروموزوم از پروب مختص آن کروموزوم ساطع می شود. سپس، شدت این فلورسانت خوانده و با روش های آماری، آنالیز می شود تا تعداد مولکول DNA هدف تعیین شود و وضعیت کروموروم های 21، 18 و 13 مشخص شود. از زمانی که پلیت وارد دستگاه می شود تا پایان کار دستگاه، حدود 3 ساعت طول می کشد. به دلیل سریع بودن این روش، میتوان تخمین زد که نتیجه نهایی آزمایش برای هر نمونه، از زمانی که نمونه وارد بخش فنی آزمایشگاه می شود، حداکثر طی 48 ساعت آماده می شود.


    روش جدید آزمایش NIPT – ان آی پی تی | روش DeNIPT، اعتبارسنجی شده است. نتایج حاصل از این اعتبارسنجی نشان داد که این روش در عمل با NIPT برپایه NGS، قابل قیاس است و می توان از آن به عنوان یک تست بالینی روتین برای بررسی آنیوپلوئیدی ها در دوران بارداری برای همه خانم های باردار استفاده کرد. نتایج اعتبارسنجی نشان داد که میزان نتایج منفی کاذب و مثبت کاذب بسیار پایین است و آزمایش از حساسیت و اختصاصیت بالایی برخوردار است.

    این روش نسبت به سایر روش های NIPT که بطور معمول انجام می شوند، روش سریعتری (Fast) است و جوابدهی آن در مدت زمان کوتاهتری امکان پذیر است. همچنین، از نظر اقتصادی در مقایسه با روش رایج NIPT برپایه NGS ارزانتر و به صرفه تر است. در واقع، مزیت این روش، قدرت تشخیصی بالا و کاهش زمان جوابدهی و میزان هزینه هاست.

    روش جدید آزمایش NIPT – ان آی پی تی


    به دلیل اینکه نتیجه نهایی آزمایش در روش DeNIPT نسبت به روش NIPT برپایه NGS، در مدت زمان بسیار کمتری آماده می شود و همچنین به دلیل اینکه دقت این روش به اندازه دقت روش NIPT برپایه NGS است. در مواردی که بررسی جنین به صورت اورژانسی ضرورت داشته باشد، برای مثال زمانی که مادر باردار در هفته های بالای بارداری است (زمان سقط قانونی جنین مبتلا به تریزومی حدود هفته 19 بارداری است) و به هر دلیلی سلامت جنین وی بررسی نشده باشد. روش DeNIPT بهترین و دقیق ترین گزینه برای بررسی تری زومی های شایع جنین در دوران بارداری است.